Anschlussprojekte
Prof. Dr. Joachim Griesenbeck
Universität Regensburg
Fakultät für Biologie -
Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie
Prof. Dr. Hinrich Boeger
University of California, Santa Cruz
Molecular Cell & Developmental Biology
Strukturanalyse von Einzelkopiengenen mit Elektronenmikroskopie und Rasterkraftmikroskopie
Das geplante Projekt basiert auf gemeinsamen Vorarbeiten in denen wir Mechanismen der Genaktivierung in dem eukaryotischen Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae (nachfolgend Hefe genannt) untersucht haben (Boeger et al., 2008; Brown et al., 2013; Hamperl et al., 2014a, 2014b). Hierzu wurden experimentelle Ansätze entwickelt, die es uns erlauben genomische Loci unter nativen Bedingungen von Hefechromosomen zu isolieren. Gene in unterschiedlichen Transkriptionszuständen konnten derart mittels Massenspektrometrie in ihrer Proteinzusammensetzung analysiert, und Nukleosomenverteilungen auf Einzelgenmolekülen über Elektronenmikroskopie (EM) bestimmt werden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen haben unser Verständnis der Wechselbeziehung zwischen transkriptioneller Aktivität eines Gens und der lokalen Chromatinstruktur erweitert.
In der kommenden Förderperiode sollen die bisherigen EM-Analysen weiter ausgebaut werden. Zudem soll getestet werden, ob Rasterkraftmikroskopie (RKM) für die strukturelle Analyse von Einzelgenmolekülen geeignet ist. Hierzu sind Kollaborationen mit Holger Schmidt (Electrical Engineering, UCSC, USA), sowie dem anerkannten RKM-Experten Dr. John van Noort (Universität Leiden, Holland) geplant. Dr. van Noort interessiert sich für die elastischen Eigenschaften von nativen Chromatinfasern. Gegenüber der bisherigen EM-Analyse verspricht der Einsatz von RKM die strukturelle Analyse von Einzelgenmolekülen zu erleichtern.
Literatur
Boeger, H., Griesenbeck, J., and Kornberg, R.D. (2008). Nucleosome retention and the stochastic nature of promoter chromatin remodeling for transcription. Cell 133, 716–726.
Brown, C.R., Mao, C., Falkovskaia, E., Jurica, M.S., and Boeger, H. (2013). Linking stochastic fluctuations in chromatin structure and gene expression. PLoS Biol. 11, e1001621.
Hamperl, S., Brown, C.R., Garea, A.V., Perez-Fernandez, J., Bruckmann, A., Huber, K., Wittner, M., Babl, V., Stoeckl, U., Deutzmann, R., et al. (2014a). Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 42, e2.
Hamperl, S., Brown, C.R., Perez-Fernandez, J., Huber, K., Wittner, M., Babl, V., Stöckl, U., Boeger, H., Tschochner, H., Milkereit, P., et al. (2014b). Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. Clifton NJ 1094, 329–341.
Ausgangsprojekt: Molekulare Mechanismen der Genaktivierung: Charakterisierung von Chromatinübergängen am Beispiel des PHO5 Promoters aus Hefe
Abschlussbericht
Die Anschlussförderung durch BaCaTeC-Mittel ermöglichte es eine bestehende Kollaboration zwischen den Arbeitsgruppen von Hinrich Boeger an der UC Santa Cruz und Joachim Griesenbeck an der Universität Regensburg weiter fortzuführen. In früheren Studien wurden bereits bedeutende Fortschritte bei der Aufklärung molekularer Mechanismen der Transkriptionsregulation gemacht [1]-[11]. Während die Erkenntnisse der ursprünglichen Arbeiten meistens auf Ergebnissen aus biochemischen zellbiologischen Analysen beruhten, sollten im Rahmen der Anschlussförderung nun strukturelle Analysen durchgeführt werden. In den vergangenen Jahren wurden gerade im Bereich der Einzelmolekül Strukturanalysen ein Durchbruch erzielt. Dadurch wird es, in Kombination mit biochemischen Analysen, möglich sein, Struktur-Funktionsbeziehungen in komplexen biologischen Systemen zu verstehen. Zu diesem Zweck sollte eine Zusammenarbeit mit der biophysikalisch, strukturell orientierten Arbeitsgruppe von John van Noort (Universität Leiden, Holland) initiiert werden.
Die BaCaTeC-Förderung ermöglichte ein erstes, äußerst produktives Treffen von Hinrich Boeger, Joachim Griesenbeck und John van Noort im Dezember 2014 in Regensburg. Aus dem Treffen ergab sich eine Kollaboration in welcher aus dem Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae unter nativen Bedingungen isolierte genomische Loci mit Hilfe von Einzelmolekülkraftmikroskopie untersucht wurden. Es wurden bislang einzigartige Einblicke in die biophysikalischen Eigenschaften von definiertem, nativ gereinigtem, genetischem Material gewonnen. Die Resultate aus diesen Studien konnten kürzlich in einer international anerkannten Fachzeitschrift veröffentlicht werden [12]. Der 2016 von den drei Gruppen unternommene Versuch eine Drittmittelförderung im Rahmen des Human Frontier in Science Programmes zu erhalten blieb leider erfolglos. Die kürzlich publizierten gemeinsamen Arbeiten mit der holländischen Arbeitsgruppe sollten eine erneute Antragsstellung auf Drittmittelförderung zur Fortführung der Projekte ermöglichen.
Referenzen
1. Boeger, H., Griesenbeck, J., Strattan, J. S. & Kornberg, R. D. Nucleosomes unfold completely at a transcriptionally active promoter. Mol. Cell 11, 1587–1598 (2003).
2. Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S. & Kornberg, R. D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell. Biol. 23, 9275–9282 (2003).
3. Boeger, H., Griesenbeck, J., Strattan, J. S. & Kornberg, R. D. Removal of promoter nucleosomes by disassembly rather than sliding in vivo. Mol. Cell 14, 667–673 (2004).
4. Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S. & Kornberg, R. D. Purification of defined chromosomal domains. Meth. Enzymol. 375, 170–178 (2004).
5. Boeger, H., Griesenbeck, J. & Kornberg, R. D. Nucleosome retention and the stochastic nature of promoter chromatin remodeling for transcription. Cell 133, 716–726 (2008).
6. Lorch, Y., Griesenbeck, J., Boeger, H., Maier-Davis, B. & Kornberg, R. D. Selective removal of promoter nucleosomes by the RSC chromatin-remodeling complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 881–885 (2011).
7. Mao, C., Brown, C. R., Griesenbeck, J. & Boeger, H. Occlusion of regulatory sequences by promoter nucleosomes in vivo. PLoS ONE 6, e17521 (2011).
8. Brown, C. R., Mao, C., Falkovskaia, E., Jurica, M. S. & Boeger, H. Linking stochastic fluctuations in chromatin structure and gene expression. PLoS Biol. 11, e1001621 (2013).
9. Hamperl, S. et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 42, e2 (2014).
10. Hamperl, S. et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 1094, 329–341 (2014).
11. Brown, C. R. et al. Chromatin structure analysis of single gene molecules by psoralen cross-linking and electron microscopy. Methods Mol. Biol. 1228, 93–121 (2015).
12. Hermans, N. et al. Toehold-enhanced LNA probes for selective pull down and single-molecule analysis of native chromatin. Sci Rep 7, 16721 (2017).