Anschlussprojekte
Dr. Florian Krach
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg - Klinikum
Stammzellenbiologische Abteilung
Prof. Dr. Gene Yeo
University of California, San Diego
Sanford Consortium for Regenerative Medicine
Untersuchungen zur TDP-43-Funktion bei sporadischer ALS und familiärer ALS mit TDP-43-Mutationen
ALS ist eine neurodegenerative Erkrankung, die Motoneuronen (MNs) betrifft. Neuropathologisch ist es durch zytoplasmatische Misslokalisierung und Aggregation des RNA-bindenden Proteins TDP-43 gekennzeichnet. Obwohl 90% der Fälle sporadisch auftreten (sALS), treten 10% der ALS-Fälle in einem mendel'schen Vererbungsmuster auf (familiäre ALS, fALS). Interessanterweise können in einem Teil der fALS-Fälle Mutationen in TDP-43 gefunden werden. Es ist aber nicht bekannt, ob diese Mutationen funktionell den Aggregationen in sALS entsprechen. Daher wollen wir dies in Stammzell-generierten MNs von Patienten mit fALS mit TDP-43-Mutationen, sALS-Fällen mit einer erhöhten Unlöslichkeit von TDP-43 und gesunden Kontrollen untersuchen. Wir werden eCLIP-seq anwenden, um Änderungen im RNA-Bindungsmuster zu identifizieren, RNA-seq, um sALS/fALS-spezifische Transkriptomänderungen abzugrenzen, und APEX2-proximity labeling, um das TDP-43-Interaktom in den verschiedenen Zuständen zu erfassen.
Abschlussbericht
Im Rahmen dieses Projekts wollten wir Gemeinsamkeiten und Unterschiede in den Transkriptommustern, insbesondere im alternativen Spleißen (AS), zwischen sporadischer (sALS) und familiärer amyotropher Lateralsklerose (fALS) in aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) gewonnenen Motoneuronen (MN) untersuchen. Unsere fALS-Kohorte bestand aus Patienten mit pathogenen Varianten in TDP-43. In sALS-Fällen enthält TDP-43 keine pathogenen Varianten, sondern aggregiert in zytoplasmatischen Einschlüssen in MNs in späten Stadien der Krankheit. TDP-43 ist ein RNA-bindendes Protein, das bei AS eine Rolle spielt. Es wird daher vermutet, dass die bei ALS auftretenden biochemischen Veränderungen von TDP-43 die AS beeinflussen.
Wir führten eine RNA-Sequenzierung von iPSC-MN von sALS- und fALS-Patienten durch und verglichen sie mit gesunden Kontrollen. Wir stellten fest, dass bei beiden ALS-Modalitäten AS-Veränderungen in iPSC-MN beobachtet werden können, was auf einen gemeinsamen molekularen Phänotyp verschiedener ALS-Fälle hinweist. Beim Vergleich der einzelnen AS-Ereignisse fanden wir eine hohe Korrelation zwischen AS-Veränderungen bei fALS und sALS, was auf einen gemeinsamen Ursprung von AS bei beiden ALS-Formen hindeutet. Um zu untersuchen, ob die RNA-Bindung von TDP-43 mit diesen AS-Veränderungen zusammenhängt, führten wir eine enhanced crosslinking and immunoprecipitation (eCLIP) sequencing von TDP-43 in iPSC-MN aus gesunden Kontrollen durch. Unsere eCLIP-Sequenzierung von TDP-43 in menschlichen MN rekapitulierte die bekannten TDP-43-Bindungsmodalitäten wie die Bindung an UG-reiche Sequenzen und intronische RNA-Regionen. Interessanterweise beobachteten wir bei der Integration dieser TDP-43-RNA-Bindungsdaten mit den fALS- und sALS-AS-Daten, dass eine geringe Anzahl von AS-Ereignissen in ALS-IPSC-MN durch TDP-43 gebunden wurde, während viele andere AS-Ereignisse keine TDP-43-Bindung aufwies. Dies deutet darauf hin, dass parallel zu TDP-43 auch andere AS-Faktoren an AS in ALS iPSC MN beteiligt sein könnten. Wir verwendeten Massenspektrometrie, um andere AS-Faktoren zu identifizieren, die das Transkriptom in ALS iPSC MN beeinflussen, und zeigten, dass diese AS-Faktoren auch zu AS in ALS iPSC MN beitragen.